3-5-1- طراحی آزمایش Plackett-Burman32
3-5-2- بهینه سازی آماری تولید آنزیم آسپاراژیناز به روش RSM34
3-6- تعیین صحت مدل پاسخ سطح35
3-7- آنالیز آماری35
3-8- روش انجام 12 آزمایش Burman- Plackett:38
3-8-1- مواد تشکیل دهنده محلول نمکی:38
3-9- رسم منحنی استاندارد آمونیاک39
3-10- تهیه ی معرف های سنجش فعالیت آنزیم39
3-11- نحوه ی سنجش فعالیت آنزیم 12آزمایش40
3-11-1- تخمیر در بستر جامد طی بهینه سازی تولید با روش RSM:41
3-11-2- اثر پارامترهای مختلف بر تولید آنزیم در بستر جامد41
3-11-3- استخراج آنزیم42
3-11-4- سنجش فعالیت آنزیم42
3-12- روش تهیه فسفات بافر:42
3-13- اندازه گیری فعالیت آسپارژیناز از نظر کمی43
فصل چهارم: نتایج44
4-1- جداسازی میکروارگانیسم45
4-2- شناسایی گونه های مولد آنزیم45
4-2-1- شناسایی مولکولی……………………………………………………………………………………..46
4-3- اندازه گیری فعالیت آسپاراژیناز از نظر کمی48
4-4- ارزیابی اولیه برخی فاکتورهای موثر بر تولید آنزیم آسپاراژیناز با استفاده از طراحی آزمایش Plackett-Burman48
4-5- طراحی آزمایش و بهینه سازی فرآیند به روش سطح پاسخ50
4-5-1- تخمیر در بستر جامد50
4-5-2- بهینه سازی آماری تولید آسپاراژیناز در بستر جامد51
4-5-3- صحت مدل سطح پاسخ54
4-5-4- نمودارهای سه بعدی تولید آنزیم در بستر جامد55
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری61
5-1- جمع بندی67
5-2- پیشنهادات67
فهرست منابع68
فهرست جداول
جدول1- 1- سویه های باکتریایی مولد ال آسپارژیناز12
جدول1- 2- اکتینومایست های مولد ال آسپارژیناز12
جدول3- 1- مواد به کار رفته در پژوهش26
جدول3- 2- مواد مورد استفاده در تهیه یک لیتر از محیط M927
جدول3-3- شرایط مختلف جهت بهینه سازی واکنش PCR……………………………………………………………30

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

جدول 3-4- ترکیب مواد برای تهیه مخلوط PCR……………………………………………………………………………….31
جدول3- 5- سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman برای تخمیر در بستر جامد33
جدول3- 6- مقادیر حقیقی بر اساس طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman برای تخمیر در بستر جامد34
جدول3- 7- سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش به روش RSM برای تخمیر در بستر جامد36
جدول3- 8- مقادیر سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش یه روش RSM برای تخمیر در بستر جامد37
جدول3-9- جدول نشان دهنده مقادیر کد شده38
جدول4-1- خصوصیات بیوشیمیایی مربوط به باسیلوس جداسازی شده46
جدول4- 2- طراحی Plackett-Burman برای هشت متغیر کد شده با فعالیت آنزیم آسپاراژیناز49
جدول4- 3- نتایج آنالیز واریانس (ANOVA) برای انتخاب منبع کرن و ازتبا روش طراحی Plackett-Burman در بستر جامد50
جدول4- 4- مقادیر مشاهده شده آسپاراژیناز تولید شده در بسترذ جامد با استفاده از روش RSM51
جدول4- 5- آنالیز واریانس (ANOVA) برای مدل مربع سطح پاسخ در بستر جامد 53

فهرست نمودارها
نمودار3- 1- منحنی استاندارد ترسیم شده برای سنجش فعالیت آنزیمی39
نمودار4- 1- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل میزان منبع کربن و نیتروژن در تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد55
نمودار4- 2- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل میزان منبع کربن و دما56
نمودار4- 3- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل منبع کربن و زمان انکوباسیون در تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد57
نمودار4- 4- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل منبع نیتروژن و دما در تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد58
نمودار4- 5- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل منبع نیتروژن در و زمان انکوباسیون در تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد59
نمودار4- 6- طراحی سطح پاسخ تاثیردما و زمان انکوباسیون در تولید تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد60
فهرست اشکال
شکل1- 1- تصویر شماتیک مکانیسم عمل آنزیم ال آسپارژیناز، واسطه کوالانسی مورد نظر از طریق حمله مزوفیلی توسط آنزیم شکل می گیرد.14
شکل1- 2- نمای شماتیک و جزئی تر از مکانیسم احتمالی عمل در ال آسپارژیناز15
شکل 3-1- برنامه دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیرتوالی مورد نظر…………………………………………………….31
شکل3- 2- نشان دهنده لوله های حاوی محلول نهایی مورد آزمایش یا test group است.41
شکل3- 3- نشان دهنده استخراج آنزیم ال آسپارژیناز با بهره گیری از کاغذ صافی است.43
شکل4- 1- محیط کشت 9 M45
شکل4- 2- باکتری های جداشده در محیط کشت 9 M45
شکل4- 3- رنگ آمیزی گرم46
شکل4-4- آنالیز کیفی استخراج ژنومی باکتری بر روی ژل آگاروز 1%……………………………………………….47
شکل-4-5 نتایج بلاست 13 باکتری تولید کننده آسپارژیناز……………………………………………………………….48
شکل4- 6- انطباق بین مقدار تجربی و مقدار پیش بینی شده در بستر جامد54
چکیده
در این تحقیق روش تخمیر در بستر جامد به منظور تولید آسپارژیناز توسط سویه جداسازی شده از جنس باسیلوس با استفاده از سبوس برنج انجام گردید.
بررسی اولیه با استفاده از طراحی Plackett-Burman نشان داد که از میان منابع کربن مورد آزمایش شامل: سبوس برنج، سبوس گندم، ساقه برنج، ساقه گندم ،سبوس برنج بهترین تأثیر را در افزایش تولید آنزیم واز میان منابع نیتروژن مورد آزمایش شامل: آسپاراژین، عصاره مخمر، پپتون ، تریپتون، آسپاراژین بهترین تأثیر در افزایش تولید آسپارژیناز را در بستر جامد نشان دادند(05/0>p). در مرحله بعدی بهینه سازی طی بررسی4فاکتور سبوس برنج، آسپارژین، دمای انکوباسیون، زمان انکوباسیون در 5 سطح بر تولید آسپارژینازبا بکار گیری روش RSM مقدار تولید آنزیم U/g24/69 حاصل شد. در بستر جامد میزان تولید آنزیم در مقایسه با بکارگیری طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman و RSM 3 برابر حاصل شد. همچنین تحقیقات برای تعیین ویژگی های آنزیم آسپارژیناز تولید شده توسط سویه باکتریایی جداسازی شده انجام پذیرفت. حداکثر میزان تولید آنزیم تجربی بدست آمده در بستر جامد در میزان غلظت سبوس برنج5/1 درصد وزنی-وزنی، میزان غلظت آسپاراژین 5/0 درصد وزنی-وزنی، دمای 30 درجه سانتی گراد، و مدت زمان 72 ساعت بود.نتایج حاکی از اهمیت تولید آسپارژیناز در بستر جامد با استفاده از سوبسترای ضایعات سبوس برنج به دلیل قیمت ارزان و قابلیت دسترسی فراوان و پتانسیل بالا در تولید آنزیم است.
کلمات کلیدی: بهینه سازی، ضایعات سبوس برنج، تخمیر در بستر جامد

فصل اول:
کلیات پژوهش
مقدمه:
آنزیم ها مواد پروتئینی هستند که توسط همه موجودات زنده ساخته می شوند و کاتالیز واکنش های شیمیایی را در سلول به عهده دارند. آنزیم ال آسپارژیناز هیدرولیز آسپارژین را به آسپارتیک اسید بر عهده دارد و توسط انواع مختلف سلول ها به ویژه میکروارگانیسم ها تولید می شود. آنزیم آسپارژیناز کاربردهای مختلف صنعتی و دارویی متعددی دارد. آسپارژیناز به عنوان ماده افزودنی به مواد غذایی افزوده می شود و جلوی سنتز اکریلامید که یک ماده کارسینوژن است را می گیرد. شناسایی آسپارژیناز به عنوان داروی ضد سرطان به سال 1953 میلادی و هنگامی که دانشمندان در موش و رت مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد سرم خوک را تزریق کردند و مشاهده شد که پیشرفت بیماری کنترل شد ، باز می گردد . بعدها مشخص شد که این خود سرم به تنهایی نبود که باعث مهار تومور شده است بلکه آنزیم ال آسپارژیناز در مهار تومور موثر بوده است. بعد از انجام تحقیقات گسترده مشخص شد که آسپارژیناز به دست آمده E.coli و Erwinia بهترین نوع داروی ضد سرطان است. آسپارژیناز هم چنین به عنوان دارو با نام تجاری ال آسپار برای درمان لوسمی حاد لنفوبلاستیک به کار می رود. بر خلاف سایر داروهای مورد استفاده در درمان لوسمی حاد لنفوبلاستیک، آسپارژیناز را می توان به صورت درون عضلانی و داخل وریدی بدون ترس از تحریک بافت به کار برد.در این پژوهش به بررسی تولید آنزیم ال آسپارژیناز در باکتری های جدا شده از خاک و بررسی فعالیت آنزیمی آن ها به روش RSM پرداخته شده است.
1-1- اهداف پژوهش
1- جداسازی باکتری های تولید کننده آنزیم ال آسپارژیناز
2- تاثیر فاکتورهای موثر محیطی و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت بر روی تولید آنزیم
3- بدست آوردن شرایط بهینه تولید آنزیم از باکتری ایزوله شده با استفاده از روش Response surface method
1-2- فرضیه های پژوهش
1- تغییر فاکتورهای محیطی و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت درافزایش تولید آنزیم ال آسپارژیناز تاثیر دارد.
2- با استفاده از روش Response surface method می توان به شرایط بهینه تولید آنزیم دست یافت.
1-3- پرسش های پژوهش
1-از بین باکتری های جداسازی شده کدامیک توانایی بیشتری در تولید آنزیم ال آسپارژیناز دارند؟
2-آیا تغییر فاکتورهای محیطی و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت درافزایش تولید آنزیم ال آسپارژیناز تاثیر دارد؟
3-آیا با استفاده از روش Response surface method می توان به شرایط بهینه تولید آنزیم دست یافت؟
1-4- تعریف اصطلاحات و واژگان تحقیق
1-4-1- آنزیم ها و ساختار آن ها
آنزیم ها موادی پروتئینی هستند که توسط سلول ها تولید شده و به عنوان کاتالیست جهت سرعت بخشیدن به این واکنش های شیمیایی که در سلول رخ می دهند، عمل می کنند. آنزیم ها می توانند سرعت واکنش های سلول را تا 106 تا 1012 افزایش داده و این امکان را ایجاد کنند که واکنش ها در دمای عادی سلول انجام بگیرد.
کار یک آنزیم این است که ساختار مولکول مورد نظر را تغییر می دهد که این تغییر می تواند اضافه کردن یک اتم به مولکول، شکافتن یک مولکول به دو مولکول کوچک تر یا به هم پیوند دادن دو یا چند مولکول کوچک برای ایجاد یک مولکول بزرگ تر باشد اما حقیقت اصلی و ثابت این است که آنزیم همواره سبب ایجاد تغییری گذرا در ماده مورد نظر می شود. [1]
آنزیم ها همانند سایر پروتئین ها از آمینو اسیدها تشکیل شده اند اما از لحاظ عملکرد با آن ها متفاوت اند و این توانایی را دارند که بدون این که ساختار خودشان دچار تغییر بشود در واکنش های شیمیایی را تسهیل کنند.
همانطور که اشاره شد آنزیم ها از به هم پیوستن واحدهای آمینو اسید توسط پیوند پپتیدی به هم ایجاد شده اند. آنزیم ها را می توان با نمک ها، حلال ها و سایر واکنشگرها رسوب داد یا دناتوره کرد. وزن مولکولی آنزیم ها از 10000 تا 2000000 متغیر است.
بسیاری از آنزیم ها برای فعالیت خود نیاز به حضور یک ماده به نام کوفاکتور دارند. به کل ساختار فعال آنزیم هولو آنزیم گفته می شود که شامل اپوآنزیم( جزء پروتئینی)+ کوفاکتور( کوآنزیم، گروه پروستتیک یا یون فلزی فعال کننده ) است.[2]
1-4-2- مکانیسم عمل آنزیم ها
بر اساس استدلال فیشر بسیاری از آنزیم ها به هنگام تشخیص کمپلکس آنزیم-سوبسترا مانند روشی که یک کلید با قفل جفت می شود عمل می کنند. به چنین قفل آنزیمی، جایگاه فعال گفته می شود. در بیشتر آنزیم ها، جایگاه فعال بر روی سطح آنزیم، شکلی شبیه به یک شکاف یا جیب را به خود می گیرد . وظیفه جایگاه فعال علاوه بر شناسایی سوبسترا، فراهم آوردن فضایی سه بعدی برای محافظت سوبسترا در برابر حلال و نیز تسهیل کاتالیز واکنش است. [1]
آنزیم ها به منظور تسهیل روند واکنش مکانیسم های متعددی را مورد استفاده قرار می دهند ولی به طور کلی ترکیب های مختلفی از چهار نوع مکانیسم عمومی، سبب ایجاد توانایی کاتالیزوری در آنزیم و افزایش سرعت واکنش است:
الف) کاتالیز واکنش از راه مجاورت:
مولکول ها برای این که بتوانند با هم واکنش بدهند باید تا حد تشکیل پیوند به هم نزدیک گردند و هر چه غلظت مولکول ها بیشتر باشد احتمال برخورد و بنابراین سرعت واکنش افزایش می یابد. هنگام برقراری اتصال بین آنزیم و سوبسترا در جایگاه فعال، ناحیه ای موضعی با غلظت بالای سوبسترا به وجود می آید. این محیط باعث فراهم شدن جهت مطلوب قرارگیری برای مولکول های سوبسترا و افزایش سرعت واکنش می شود.[3]

ب)کاتالیز اسید-باز
گروه های فعال با قابلیت یونیزه شدن در زنجیره جانبی اسیدهای آمینه و یا گروه های پروستتیک، از راه خاصیت اسیدی یا بازی در فرایند کاتالیز شرکت می کنند. این نوع کاتالیز می تواند به صورت عمومی یا اختصاصی انجام شود. در نوع اختصاصی سرعت واکنش به تغییرات غلظت پروتون ها حساسیت دارد و به غلظت سایر اسیدها یا بازها ارتباطی ندارد. سرعت واکنش های عمومی به تغییرات همه اسیدها یا بازهای موجود در محیط بستگی دارند. [4]
ج)کاتالیز کششی
در واکنش های لیتیک آنزیم های مربوطه به نحوی به سوبسترای خود وصل می شوند و با ایجاد نوعی حالت گذار،شکل فضایی پیوندی که باید شکسته بشود را تاحدودی نامطلوب می سازند. به این صورت کشش ایجاد شده پیوند مذکور را سست کرده و آن را برای شکستن مستعد می سازد. [5]
د)کاتالیز کوالانسی
در این نوع فرایند میان آنزیم و یک یا چند سوبسترا پیوند کوالانسی به وجود می آید و آنزیمی که به این صورت تغییر پیدا کرده وارد واکنش می شود. این نوع کاتالیز واکنش را از مسیری با انرژی فعال سازی کمتر و در نتیجه سرعت بیشتر هدایت می کند و بعد از انجام واکنش آنزیم دوباره به حالت اول خود باز می گردد.[4]
1-4-3- عوامل موثر بر فعالیت آنزیم ها
داشتن اطلاعات پایه در رابطه با تئوری کینتیک در تحلیل و شناسایی آنزیم ها هم برای درک مکانیسم پایه ای آنزیمی و هم برای انتخاب روش مناسب در سنجش فعالیت آنزیم موثر و مفید است. شرایطی که برای ارزیابی فعالیت یک آنزیم در نظر گرفته می شود با شرایط مورد نظر درمورد ارزیابی غلظت سوبسترا مانند هم نیستند. عوامل متعددی وجود دارند که واکنش آنزیمی را تحت تاثیر قرار می دهند مانند، دما، pH ، غلظت آنزیم، غلظت سوبسترا و حضور بازدارنده ها و فعال کننده ها. [3]
الف)تاثیر دما بر واکنش های آنزیمی
مانند سایر واکنش های شیمیایی، نسبت واکنش کاتالیز شده توسط آنزیم با افزایش دما افزایش پیدا می کند. افزایش دما تا 10 درجه سانتی گراد باعث افزایش فعالیت آنزیم به میزان 50 تا 100% می شود. در برخی از واکنش های آنزیمی افزایش دما تاثیر معکوس روی واکنش دارد. البته دمای بالای 40 درجه نیز برای عملکرد اکثر آنزیم ها مناسب نیست و باعث دناتوره شدن یا غیرفعال شدن آن ها می شود. اکثر آنزیم ها در شرایط آزمایشگاهی در دمای 5 درجه سانتی گراد نگه داری می شوند و یخ زدگی باعث از دست رفتن فعالیت در برخی از آنزیم ها می شود. [4]
ب) تاثیر pH
آنزیم ها تحت تاثیر تغییرات pH قرار می گیرند. مناسب ترین میزان pH که در آن آنزیم بیشترین فعالیت را دارد pH اپتیمم یا بهینه نام دارد. میزان خیلی بالا یا پایین pH منجر به از دست رفتن فعالیت آنزیمی می شود. هم چنین pH یکی از عوامل موثر در ثبات و پایداری آنزیم به شمار می آید. آنزیم ها دارای محدوده ای از pH بهینه برای ثبات خود هستند.
ج)غلظت آنزیم
برای بررسی تاثیر غلظت بالای آنزیم در سرعت واکنش، سوبسترا باید در مقدار زیاد حضور داشته باشد به عنوان مثال واکنش باید مستقل از غلظت سوبسترا باشد. به این ترتیب هر تغییری در میزان محصول تولید شده با میزان حضور آنزیم مرتبط خواهد بود. به این نوع واکنش ها “zero order” گفته می شود چون سرعت آن ها مستقل از غلظت سوبسترا و برابر با ثابت K است. [5]
د) غلظت سوبسترا
از لحاظ تجربی نشان داده شده است که اگر مقدار آنزیم ثابت نگه داشته شود غلظت سوبسترا تدریجا افزایش می یابد و شدت واکنش تا رسیدن به یک مقدار بیشینه افزایش می یابد. بعد از این مرحله با افزایش میزان سوبسترا شدت واکنش افزایش پیدا نخواهد کرد.
د)تاثیر بازدارنده ها
بازدارنده های آنزیمی موادی هستند که عملکرد کاتالتیک آنزیم را تحت تاثیر قرار می دهند و در نهایت باعث کاهش سرعت یا توقف واکنش می شوند. سه نوع بازدارنده آنزیمی متداول وجود دارد:‌ بازدارنده رقابتی، غیررقابتی و بازدارنده سوبسترا. [6]
1-4-4- انواع آنزیم
آنزیم ها معمولا بر اساس ترکیباتی که روی آن ها اثر می کنند نام گذاری می شوند.برخی از مهم ترین آن ها مانند لیپاز که روی چربی ها اثر می کند و باعث شکسته شدن آن ها به اسید چرب و گلیسرول می شود، پروتئازها که پروتئین ها را به زنجیره های پلی پپتیدی و در نهایت ساختارهای پپتیدی کوچک و آمینو اسیدها می شکند، آمیلاز که نشاسته را به قندهای ساده تر مانند آمیلوز می شکند یا سلولاز که سلولز را به واحدهای گلوکز تبدیل می کند.[7]
نوع دیگری از طبقه بندی آنزیم ها بر اساس واکنش هایی است که کاتالیز می کنند:
1.اضافه کردن یا حذف آب
الف)هیدرولازها مانند استراز ها، کربوهیدرازها، نوکلئازها، دآمینازها، آمیدازها و پروتئاز ها
ب)هیدرازها مانند فوماراز، انولاز، آکونیتاز و کربنیک انهیدراز
2)انتقال الکترون
الف) اکسیدازها
ب) دهیدروژنازها
3) انتقال گروه
الف)ترانس گلیکوزیداز
ب)ترانس فسفوریلاز و فسفوموتازها
ج) ترانس آمیناز
د) ترانس متیلاز
ه) ترانس استیلاز
4) ایجاد یا شکستن پیوندهای کربن-کربن
الف) دسمولازها
5) تغییر شکل هندسی یا ساختار مولکول
الف) ایزومرازها
6) پیوستن دو مولکول به هم از طریق هیدرولیز ATP یا سایر مولکول های تری فسفات
الف) لیگاز ها[5]
1-4-5- آنزیم های میکروبی و انواع آن ها
آنزیم ها در همه سلول های زنده و بنابراین در همه میکروارگانیسم ها حضور دارند. هر میکروارگانیسم تعداد زیادی آنزیم هیدرولیز کننده، اکسید یا احیا کننده و متابولیک را برای خود در طبیعت تولید می کند. اما میزان مطلق و نسبی هر یک از این آنزیم های تولید شده بین گونه های مختلف و حتی بین سوش های مختلف یک گونه متفاوت است. بنابراین طبیعی است که سویه ای را برای تولید آنزیم در مقیاس صنعتی و تجاری انتخاب کنیم که میزان بیشتری از آنزیم مورد نظر ما را تولید می کند. آنزیم های تجاری و صنعتی بیشتر از کپک ها، باکتری ها و مخمرها تولید می شوند. [8]
آنزیم های میکروارگانیسم ها نسبت به آنزیم های گیاهی و جانوری در استفاده صنعتی و تجاری برتری دارند زیرا، دسترسی به آنها آسان تر است،‌ افزایش بازده تولید در فرایند میکروبی ساده تر از فرایند های گیاهی و جانوری است، از لحاظ اقتصادی تولیدشان مقرون به صرفه است، امکان دستکاری های ژنتیکی بر روی آن ها نسبت به آنزیم های گیاهی و جانوری بیشتر است،‌ به علاوه تنوع فعالیت کاتالتیک آن ها بیشتر است. در محدوده وسیعی از pH فعال هستند، در عین حال با استفاده از فناوری DNAنوترکیب می توان آنزیم های با منشا جانوری را با بهره گیری از میکروارگانیسم ها تولید کرد. آنزیم های میکروبی به دلیل داشتن چنین ویژگی هایی توجه محققین را به سوی خود جلب کرده اند.[7]
تا ده سال پیش آنزیم های صنعتی باکتریایی و قارچی با روش کشت سطحی به دست می آمدند که هم اکنون روش های کشت Submerged به صورت گسترده مورد استفاده قرار می گیرند.
اما زمانی که استفاده از آنزیم های میکروبی در مقاصد درمانی مد نظر است بعضی مسائل قابلیت استفاده آن ها را پایین می آورد. یکی از مهم ترین این مشکلات اندازه مولکولی بزرگ بیوکاتالیست هاست که از توزیع آن ها در سلول سوماتیک جلوگیری می کند. مشکل دیگر برانگیخته شدن پاسخ ایمنی سلول میزبان بعد از تزریق و ورود پروتئین بیگانه است. البته دانش مدرن امروز با با تغییرات کوالانسی می تواند آنزیم را با یک ماده غیر پروتئینی دیگر احاطه کند و بر این مشکل غلبه نماید.
برخی از آنزیم های مهم میکروبی که در مقاصد درمانی مورد استفاده قرار می گیرند به شرح زیر هستند:
ال-آسپارژیناز: خاصیت ضد توموری، ال گلوتامیناز: خاصیت ضد توموری، سوپراکسید دیسموتاز: آنتی اکسیدان وضد التهاب، سراتیو پپتیداز: ضد التهاب، پنی سیلین آسیلاز: سنتز صنعتی آنتی بیوتیک، کلاژناز: درمان ضایعات پوستی، لیپاز: تجزیه زیستی لیپیدها، استرپتوکیناز: ضد انعقاد، یوروکیناز: ضد انعقاد، لاکاز: سم زدا، ال آرژیناز: ضد تومور، ریبونوکلئاز: ضد ویروس.[9]
1-4-6- معرفی آنزیم ال-آسپارژیناز
آنزیم ال آسپارژیناز، در صنعت رو به رشد استفاده از آنزیم های میکروبی اخیرا توانسته است از جایگاه مناسبی برخوردار بشود که این به دلیل پتانسیل آنزیم مذکور برای استفاده در درمان لنفوبلاستوماهای بدخیم به ویژه لوسمی لنفوبلاستیک حاد و لنفوسارکوما و نیز استفاده در صنایع غذایی برای جلوگیری از تشکیل اکریلامیدها در مواد غذایی سرخ شده در حرارت بالا است. این آنزیم گزینه ای برای درمان لنفومای غیر هوچکین، کارسینومای پانکراتیک ، لنفوسارکومای گاوی نیز هست همین خاصیت ضد سرطانی باعث شده تا توجه محققین بیش از پیش به سمت آن معطوف گردد.
عملکرد ضد سرطانی این آنزیم مربوط به احیا ال-آسپارژین است و دلیل این امر در ناتوانی سلول های توموری در سنتز آسپارژین است که به این ترتیب به صورت انتخابی فقط سلول های توموری کشته می شوند. [10]
این آنزیم اولین بار در سال 1953 و با کشف این مسئله که عامل ضد لنفوما در سرم خوک های گینه ای ال آسپارژیناز بوده است نظر دانشمندان را به خود جلب کرد.[11]
آنزیم ال آسپارژیناز واکنش تبدیل ال آسپارژین را به ال آسپارتیک اسید و آمونیاک کاتالیز می کند. سمیت انتخابی روی سلول های لوسمیک بدون تاثیر گذاشتن روی سلول های سالم به دلیل کاهش موثر سطح ال آسپارژین در پلاسما در بدن ایجاد می شود که منجر به جلوگیری از سنتز پروتئین و در نهایت توقف سنتز DNAو RNA می شود که القا آپوپتوز در سلول مبتلا به لوسمی را در پی خواهد داشت. سلول های توموری نیازمند به دست آوردن آمینو اسید ال آسپارژین از مایعات بدن نیاز دارند. از آن جایی که برخی از سلول های مبتلا به لوسمی به طور کامل با سلول های طبیعی متفاوت هستند، قادر به ساختن آسپارژین سنتتاز نیستند و به طور کامل به ال آسپارژین اگزوژن وابسته هستند[12] ال آسپارژیناز جایگزین مناسبی برای روش های متداول و استاندارد شیمی درمانی در این زمینه به حساب می آید. به کارگیری چنین پروتئین های آنزیمی برای مدت طولانی، باعث تولید آنتی بادی مشابه در بافت ها در نتیجه شوک آنافیلاکتیک یا خنثی سازی تاثیر دارو می شود، بنابراین استفاده از ال آسپارژیناز جدید سرولوژیک با تاثیرات درمانی مشابه به شدت مطلوب است.[13]
در بیشتر میکروارگانیسم ها ال آسپارژیناز به صورت یک محصول داخل سلولی هم در فضای پریپلاسمی و هم در سیتوپلاسم تجمع می یابد.
آنزیم ال آسپارژیناز علاوه بر خاصیت ضد سرطانی تاثیرات شدید ایمونو ساپرسیو در شرایط in vivo و in vitro دارد.[14]
1-4-7- منابع تولید آنزیم ال آسپارژیناز
آنزیم ال آسپارژیناز در بسیاری از بافت های جانوری، گیاهی و باکتری ها و در سرم گروه های خاصی از جوندگان یافت می شود ولی در انسان وجود ندارد. باکتری های متعددی قادر به تولید ال آسپارژیناز هستند که به مهم ترین آن ها در جدول زیر اشاره شده است.
جدول1- 1- سویه های باکتریایی مولد ال آسپارژیناز
Serratia marcescensEntrobacter aerogenesE.coliErwinia carotovora Pseudomonas aeroginosaPseudomonas stutzeriBasilus subtilis
جدول1- 2- اکتینومایست های مولد ال آسپارژیناز
Streptomyces griseusStreptomyces albidoflavus,S.karnatakensisS.albidoflavusNocardia spدر میان مخمر ها ساکارومیسس سرویزیه قادر به تولید آنزیم ال آسپارژیناز می باشد علاوه بر این گونه های قارچی مانند Aspergillus tereus و Aspergillus tamariو برخی دیگر از قارچ های رشته ای نیز مولد این آنزیم هستند.[15]
باکتری E.coli دو نوع ال آسپارژیناز تولید می کند: ال آسپارژیناز I که در سیتوپلاسم یافت می شود و ال آسپارژیناز II که در فضای پریپلاسمی وجود دارد. این دو نوع آنزیم از لحاظ شرایطی که در آن ساخته می شوند با هم متفاوت هستند. ال آسپارژیناز I به صورت پیوسته سنتز می شود و ال آسپارژیناز II تحت شرایط بی هوازی و محیط های با تراکم بالای آمینو اسید و حضور مقادیر ناچیز یا به طور کلی غیاب قندها ساخته می شود. بنابراین وقتی باکتری به صورت هوازی در محیط حاوی گلوکز رشد می کند فقط آنزیم سیتوپلاسمی را تولید می کند. این آنزیم به E.coli اجازه می دهد تا ال آسپارژیناز را به عنوان منبع خالص نیتروژن استفاده کند.[16]
آنزیم ال آسپارژیناز II در E.coli یا EcAII تمایل شدیدی به پیوند با سوبسترا دارد و Km آن برابر با
5-10* 15/1است. در حالی که EcAI تمایل کمتری به سوبسترا دارد و بنابراین برای مقاصد درمانی در زمینه سرطان مناسب نیست.[17]
1-4-8- مکانیسم عمل و ساختار آنزیم ال آسپارژیناز
ساختار کریستالی آنزیم ال آسپارژیناز در E.coli و ، Erwinia carotovora مورد شناسایی و بررسی قرار گرفته است. هر دوی این آنزیم ها به صورت هموتترامر فعال هستند؛ هر دوی این آنزیم ها دارای چهار زیر واحد مشخص 326 واحدی هستند. در هر یک از چهار جایگاه فعال یک مولکول محصول واکنش ال آسپارژین متصل شده است که تعیین کننده تقابل میان آنزیم و سوبسترا است.
تترامر آنزیمی از یک جفت دایمر و یک رابط دایمری بزرگ تشکیل شده است. دایمرهای این تترامر را با عنوان دایمرهای نزدیک به هم توصیف کرد. هر کدام از این دایمرهای نزدیک به هم دارای دو جایگاه فعال هستند و هر جایگاه فعال دارای بخشی از بقایای هر دو مونومر در دایمرهای نزدیک به هم است. در E.coli ساختار کریستالی حاوی چهار مولکول ال آسپارتات است، که هر یک به یک جایگاه فعال متصل هستند.[18]
گرچه دایمرهای نزدیک به هم برای تشکیل جایگاه فعال ضروری هستند، اما این واکنش ها اکثرا در درون یک زیر واحد شکل می گیرند و دو بنیان ترئونین(ترئونین 12 و ترئونین89) در آن دخالت دارند، که مقابل هر دو طرف زنجیره جانبی مولکول لیگاند قرار دارند. از آن جایی که هر دو بنیان ترئونین برای فعالیت ضروری هستند برای مدت های طولانی این سئوال مطرح بود که کدام یک از آن ها OHنوکلئوفیل را برای حمله به اتم کربن پیوند آمیدی به کار می برندکه البته به نظر می رسد ترئونین 12 این نقش را بر عهده داشته باشد.[19،17]
مکانیسم عمل آنزیم ال آسپارژیناز دقیقا مشخص نشده است اما هیدرولیز طی دو مرحله و از طریق تشکیل واسطه بتا-آسیل آنزیم پیشرفت می کند. شکل زیر نمای شماتیکی از مکانیسم عمل احتمالی آنزیم را به نمایش می گذارد:
شکل1- 1- تصویر شماتیک مکانیسم عمل آنزیم ال آسپارژیناز، واسطه کوالانسی مورد نظر از طریق حمله مزوفیلی توسط آنزیم شکل می گیرد. [20]
به طور کلی مکانیسم عملکرد در ال آسپارژیناز با سرین پروتئازهای کلاسیک قابل مقایسه است که فعالیت در آن ها به حضور یک سری از بنیان های اسید آمینه به صورت معمول Ser-His-Asp که با عنوان مثلث کاتالتیک از آن یاد می شود بستگی دارد.[21]
این مجموعه دارای یک بنیان نوکلئوفیل (Ser) یک باز عمومی (His) و یک بنیان اسیدی (Asp) است که همگی توسط یک زنجیره از پیوندهای هیدروژنی به هم متصل شده اند. واکنش در دو مرحله پیشرفت می کند. مرحله اول بخش نوکلئوفیل آنزیم از طریق یک پیوند O-H… قوی به یک بنیان بازی جایگزین متصل شده و به یک اتم کربن از بخش آمیدی سوبسترا حمله می کند که به یک حالت گذار از تتراهدرال به یک واسطه آسیل منجر می شود. بار منفی روی اتم اکسیژن گروه آمید در حالت گذار با یک دهنده پروتون مجاور تثبیت می شود. مجموعه این دهنده ها به عنوان مجرای اکس آنیون شناخته می شوند. مرحله دوم نیز مشابه مرحله اول است اما در این جا حمله به اتم کربن استری با یک مولکول آب فعال شده نوکلئوفیل صورت می گیرد. [22]
شکل1- 2- نمای شماتیک و جزئی تر از مکانیسم احتمالی عمل در ال آسپارژیناز [18]
1-4-9- خاک و میکروفلور آن
خاک یک تشکیلات پیچیده است که اکوسیستم خاک را شکل می دهد.
ترکیب کلی خاک شامل مواد معدنی،موجودات زنده، هوا و مواد محلول است. خاک در تشکیل بیومس اولیه نقش دارد و گیاهان را در خود جای داده است و آب و مواد معدنی لازم را در اختیار آن ها می گذارد. فرایند تجزیه مواد آلی و تجمع و تشکیل هوموس در خاک رخ می دهد.
خاک بر اساس ترکیب شیمیایی و ویژگی های فیزیکی اش زیستگاه مناسبی برای میکروارگانیسم ها و سایر موجودات زنده تشکیل می دهد.
موجودات زنده خاک را بر اساس اندازه به سه گروه می توان تقسیم کرد که ترکیب آن ها بسته به نوع محیط اطرافشان متفاوت است:
میکروبیوتا: موجودات در اصطلاح ذره بینی که با چشم غیر مسلح قابل رویت نیستند مانند، ویروس ها، باکتری ها، قارچ های میکروسکوپی، پروتوزواها و جلبک ها
مزوبیوتا: 0.2-2 mm)) شامل نماتودها، مایت ها، میراپدها، حشرات بدون بال، حلزون ها و برخی گیاهان ریز
ماکروبیوتا: (>2 mm) کرم های خاکی، حشرات بزرگ تر، جوندگانی مانند موش و ریشه گیاهان بزرگ .[23]
به طور کلی میکرو بیوتا یا همان میکروفلور خاک نقش مهمی را برعهده دارد . یکی از عمده ترین فعالیت های میکروفلور خاک مشارکت در تجزیه و تغییرات زیستی مواد آلی است. میکروارگانیسم ها می توانند با هم زیستی با گیاهان یا جلبک ها تثبیت نیتروژن انجام داده و همینطور باعث بهبود بافت خاک و نیز اکسیژن رسانی به آن بشوند.هم چنین متابولیت های تولید شده توسط این میکروارگانیسم ها از اهمیت بسزایی در پزشکی، داروسازی، صنایع غذایی و … برخوردار است.[23]
در این پژوهش به جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز از خاک و نیز سنجش فعالیت آنزیمی آن به روش RSM پرداخته شده است.
1-4-10- تخمیر در بستر جامد
از چنین هزارسال پیش تا کنون در آسیا از تخمیر بر روی بست جامد بر روی تولید غذا های تخمیری متنوعی استفاده شده است ولی این روش به ندرت در اروپا و آمریکای شمالی به کار می رود. این روش از طریق رشد میکروارگانیسم بر روی مواد جامد که معمولا ترکیبات آلی و فاقد آب آزاد می باشد صورت می گیرد.بستر های مورد استفاده اغلب غلات ،سبوس،بقولات و مواد سلولوزی مثل کاه و خرده چوب و … می باشد. فرایندهای سنتی عمدتا برای تولید غذاهای تخمیری مثل تمپه و سوفوی شرقی ،پنیرها،قارچ های خوراکی ،کمپوست و موادسیلویی به کار می روند.بعلاوه امروزه آنزیم ها ،اسید های آلی از طریق تخمیر در بستر جامد تولید می شوند.[24]
فرایند های تخمیر در بستر جامد فاقد مکانیسم های کنترل پیشرفته ای هستنذ که در تخمیر غوطه ور وجود دارد می باشند.اغلب این تخمیرها به دلیل فقدان آگاهی از کنتیک رشد میکروبی تحت چنین شرایطی استفاده نمی شوند.کنترل محیط درون بیورآکتوربخصوص حفظ همزمان درجه حرارت و رطوبت نیز دشوار است.البته در بعضی موارد تخمیردر بستر جامد مناسب ترین روش برای تولید فرآورده های خاص می باشد.به عنوان مثال برخی قارچ ها درتخمیرهای غوطه ور تشگیل اسپور نمی دهندولی در تخمیر بر روی بستر جامد اسپور تشکیل می شود.
این روش به طور موفقیت آمیزدر تولید اسپورهایContiothyrium minitans برای کنترل بیولوژیکی قارچ بیماری زای گیاهی Slcerotinia sclerotiorum به کار می رود.
تخمیر در بستر جامد فرایندی چند مرحله ای می باشد که شامل :
1-پیش تیمار بستر
2-هیدرولیز بستر های پلی مری مثل پلی ساکارید ها و پروتـین ها
3-مصرف فرآورده های هیدرولیز شده
4-جدا سازی و تصفیه فرآورده های نهایی
میکروارگانیسم های به کار رفته در تخمیرهای بستر جامدمیکروارگانیسم هایی هستند که فعالیت آبی نسبتأ پایین 7/0aw= را تحمل می کنند[24]
1-4-10-1- سوبستراهای مورد استفاده برای تولید آنزیم در بستر جامد
در سیستم تخمیر به روش جامد، ضایعات کشاورزی به عنوان بهترین سوبسترا مطرح هستند. از سوبستراهای مختلفی برای کشت میکروارگانیسم ها جهت تولید آنزیم به کار گرفته شده اند. بعضی از سوبستراها شامل تفاله نیشکر، کاه گندم، کاه برنج، پوست ذرت، پوست گندم، پوست برنج، پوست نخود، سبوس برنج، پوست سویا، ضایعات مو انگور، خاک اره، چوب ذرت، الیاف نارگیل، ضایعات چای، تفاله نیشکر چغندر، روغن کیک نارگیل، آرد گندم، آرد ذرت و ….هستند. انتخاب سوبسترا برای تولید آنزیم در فرایند تخمیر در بستر جامد وابسته به فاکتورهای متعدداز قبیل قیمت و قابلیت دسترسی سوبسترا است.[25]
در فرایند تخمیر در بستر جامد،سوبسترا جامد نه تنها به عنوان ماده غذایی برای رشد میکروب است بلکه به عنوان جایگاهی برای اتصال سلول است.سوبسترایی که تمام نیاز های غذایی مورد نیاز میکروارگانیسم ها را برای رشد فراهم میکند به عنوان سوبسترای ایده ال مطرح می شود[25]
معمولأ ذرات کوچک سوبسترا سطح وسیعی را برای حمله میکروبی فراهم می کنند. کوچکی بیش از حد ذرات سوبسترا احتمال تراکم میکروبی را زیاد می کند که خود مانع ازتنفس میکروب ها یا هوادهی شده و نتیجه آن کاهش رشد است.[25]
اکثر روش های تخمیر در بستر جامد،فرایند های ناپیوسته هستند اگرچه تلاش هایی در جهت ارتقاء آنها به سیستم های نیمه پیوسته وپیوسته صورت گرفته است.برخی از فرایندها نیازی به بیورآکتور ندارند و از طریق بخش بستربر محیط مناسب صورت میگیرد.فرآیندهایی که برای آنها از ظروف تخمیر استفاذه می شود،نوسانات زیادی دارند[24]
فصل دوم:
ادبیات و سوابق تحقیق
2-1- مروری بر پیشینه تحقیق
در رابطه با جداسازی باکتری های مولد آنزیم ال آسپارژیناز در ایران پژوهشی برای جداسازی باکتری های هالوفیل مولد ال آسپارژیناز از دریاچه مهارلو توسط ابراهیمی نژاد و همکاران( 2011) صورت گرفته است.
در پژوهش صورت گرفته که برای سنجش تاثیر شرایط هالوفیلیک انجام شده است مشخص گردید که Bacillus sp. BCCS 034 بالاترین میزان تولید آنزیم خارج سلولی IU/ml) 64/1 (را داشته است[24].
Ceder درسال 1968 گزارش داد که ال آسپارژیناز با یک سرعت ثابت به وسیله E.coli تحت شرایط بی هوازی سنتز می شود[27].
در مورد شناسایی و جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز پژوهشی توسط Audipudi و همکاران در هند( 2013) انجام شده است که در آن باکتری های مولد ال آسپارژیناز از خاک های مانگرویی جداسازی و شناسایی شده اند. این باکتری ها بیشتر متعلق به جنس باسیلوس و سودوموناس بوده اند [28].
پژوهشی با هدف جداسازی میکروارگانیسم های مولد ال آسپارژیناز از گیاه Ocimum sanctum. L توسط Karnataka (2010) صورت گرفته است. در این تحقیق تمامی میکروارگانیسم های جداسازی شده قادر به رشد در محیط حاوی آسپارژین به عنوان منبع نیتروژن بودند [29].
Yasser در سال 2002 بر روی تولید ال آسپارژیناز به وسیله Pseudomonas aeruginosa بر روی محیط کشت جامد کار کرد و همچنین بر روی تکامل و بهینه سازی محیط کشت با تاثیر فاکتورهای مختلف تحقیق کرد[30].
در تحقیق دیگری که در رابطه با جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز توسط Kambleو همکاران( 2012)از خاک نمکی و آب صورت گرفته است محیط کشت خاصی برای جداسازی این باکتری ها طراحی شده و بیشتر ایزوله ها مربوط به جنس Serratia ، Basilus،Aeromonas Proteus بوده اند. E.coliو Pseudomonas aeroginosa نیز در میان این ایزوله ها وجود داشته است [18].
. Younes Ghasemi در سال (2008) بر روی تغلیظ اجزای اصلاح شده محیط کشت مختلف و منابع کربن مختلف که برای بهینه کردن محیط کشت استفاده شده تحقیق نموده وهمچنین بر روی جداسازی ال آسپارژیناز در E.coli مطالعه کرده است [31].
در پژوهش صورت گرفته توسط Bashaدر سال 2009 Actinomycete ها برای سنجش فعالیت آنزیمی غربال گری شدند.[32].

دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید